Derin Okuma — CHO Biyoreaktörü

Hücrenin çelik içindeki sessiz mesaisi

İçi boş görünen paslanmaz bir tank düşün. Yirmi bin litre hacimli, cidarları elektro-parlak, içinde tek bir insan eli yok. Sabah altıda operatör panelde bir sıcaklık eğrisini onaylıyor, akşam altıda tankın içindeki sıvı artık milyonlarca doz ilacın ham maddesini taşıyor. Aradaki on iki saatte ne olduğunu kimse gözle görmedi.

Tankın içinde yaşayan şey bir kimyasal reaksiyon değil. Canlı bir hücre kültürü. Çin hamsteri yumurtalık hücresi, kısaca CHO. Kırk yıldır biyoteknoloji endüstrisinin belkemiği olan, laboratuvarda değil fabrikada yaşamaya alıştırılmış bir hücre hattı.

Peki neden bir hayvan hücresi, bakterinin yapamadığını yapıyor?

Neden bakteri değil de hamster hücresi

Escherichia coli bir proteini saatler içinde üretir. Karbon kaynağını verirsin, sıcaklığı sabitlersin, kırk sekiz saat sonra hasat edersin. Maliyet düşük, ölçek kolay. Ama işin içine glikolizasyon girince tablo değişiyor.

Glikolizasyon, proteine şeker zinciri takma işlemi. Bir benzetmeyle, üretilen proteine kimlik kartı iliştirmek gibi. Kart olmadan protein bağışıklık sistemine yabancı görünür, kanda yarı ömrü dakikalara düşer, hedefe ulaşamaz. Bakteri bu kartı takamaz çünkü içinde gerekli enzim seti yok.

CHO hücresi takar. İnsan proteinlerine yakın bir glikan profili üretir, sialik asit kalıntılarını doğru uçlara bağlar, karmaşık dallanmaları yönetir. O yüzden monoklonal antikorların neredeyse tamamı, karmaşık glikoproteinlerin büyük kısmı CHO platformunda üretilir. Endüstri tek bir hücre hattına bağımlı hale gelmiştir ve bu bağımlılık kırk yıldır çözülmemiştir.

Bağımlılığın derinliği rakamlarda saklı. Bir antikor molekülünün Fc bölgesindeki tek bir glikan ağacı, kanda yarı ömrünü belirleyen asıl kaldıraçtır. Ağacın ucundaki sialik asit sayısı arttıkça molekül karaciğerdeki asyaloglikan reseptöründen kaçar, dolaşımda haftalarca kalır. Sialik asit eksikse aynı molekül saatler içinde temizlenir. Bakteri bu ucu bağlayamaz, maya ise bağlar ama yanlış yere bağlar. Maya glikanları yüksek mannoz içerir ve bu desen insanda hızla immünojenik tanınır. Yani glikan profili, ürünün sadece etkinliğini değil, güvenliğini de belirler.

CHO hattının kendisi de tek tip değil. DG44, DUXB11, CHO-K1, CHO-S gibi alt hatlar farklı büyüme ve üretkenlik profilleri taşır. Hangi alt hattın seçileceği, üretilecek proteinin glikan ihtiyacına ve tesisin mevcut platformuna göre değişir. Bir antikor için DG44 iyi çalışırken, yüksek sialilasyon gerektiren bir füzyon proteini için farklı bir hat gerekebilir. Hücre hattı geliştirme süreci, tek bir klonun seçilmesi için altı ile on iki ay arasında sürer ve bu süre ilacın pazara çıkış takvimini doğrudan belirler.

Peki bu hücre çelik tankta nasıl hayatta kalıyor?

Karıştırma, oksijen ve köpüğün gizli savaşı

CHO hücresi bir biyoreaktörde üç şeye aynı anda muhtaç. Besin, oksijen, ve mekanik olarak hayatta kalma şansı. Üçüncüsü en sinsisi.

Tankın içinde bir impeller döner. Görevi besini dağıtmak, oksijeni çözmek, sıcaklığı homojenleştirmek. Ama aynı impeller hücreleri keser. Devir sayısı ile hücre canlılığı arasında doğrudan bir ters ilişki vardır. Çok yavaş dönersen oksijen dibe çöker, hücreler boğulur. Çok hızlı dönersen hücre zarı yırtılır, kültür ölür.

Tipik bir üretim reaktöründe impeller uç hızı saniyede bir ile iki metre arasında tutulur. Aralık, oksijen transfer katsayısı ile hücre hasarı eğrisinin kesiştiği dar bir banttır. Ölçek büyüdükçe bu bant daha da daralır çünkü tankın çapı arttıkça aynı uç hızı için devir düşer, ama karıştırma verimi de düşer.

Buradaki mühendislik düğümü, ölçek büyütmenin doğrusal olmamasıdır. Küçük bir reaktörde karıştırma süresi saniyelerle ölçülürken, iki bin litrelik bir tankta aynı homojenlik için dakikalar gerekir. Karıştırma süresi uzadıkça hücrelerin maruz kaldığı yerel pH ve oksijen gradyanları büyür. Tankın dibindeki bir hücre ile üstündeki bir hücre, aynı anda farklı koşullarda yaşar. O yüzden ölçek büyütme çalışmaları, geometrik benzerlik yerine sabit uç hızı ya da sabit güç/hacim oranı gibi ampirik kurallarla yürütülür ve her kural farklı bir taviz verir.

Oksijen tarafında iş daha da incelikli. Havadaki oksijen suda az çözünür. Hücrenin ihtiyacı ise yüksek. Çözünmüş oksijen konsantrasyonu genelde yüzde otuz ile elli hava doygunluğu arasında tutulur. Altına inerse metabolizma laktata kayar, üstüne çıkarsa oksidatif stres birikir. Bandı korumak için tankın tabanına mikro kabarcık sparger yerleştirilir, üstüne de köpük kırıcı bir sistem eklenir.

Oksijen transfer katsayısı, kısaca kLa, bu işin merkezindeki sayıdır. Bir benzetmeyle, gazın sıvıya geçiş hızını ölçen bir musluk ayarı gibi. Tipik bir üretim reaktöründe kLa değeri saatte on ile elli arasında değişir. Hücre yoğunluğu arttıkça oksijen talebi doğrusal değil, katlanarak büyür. Yirmi milyon hücre/mililitre yoğunluğa ulaşan bir kültürde, oksijen talebi başlangıçtakinin on katına çıkar ve sparger kapasitesi yetmezse kültür laktik asit üretmeye başlar. Laktat birikimi pH'ı düşürür, baz eklemesi artar, ozmolarite yükselir ve hücreler yorgun düşer.

Köpük meselesi hafife alınmaz. Protein üretimi arttıkça ortam viskozitesi yükselir, yüzeyde kararlı köpük oluşur. Köpük hücreleri taşır, tankın üst boşluğuna sürükler, orada ölürler. Antifoam eklemek çözüm gibi görünür ama fazlası oksijen transferini bozar, ayrıca downstream saflaştırmada baş ağrısı yaratır. Operatör sürekli bir denge arar.

Antifoam'ın dozu tipik olarak ortam hacminin binde biri ile binde beşi arasında tutulur. Kadar küçük bir aralık, çünkü fazlası kLa'yı yüzde otuza kadar düşürebilir ve silikon bazlı antifoamlar Protein A reçinesine yapışıp saflaştırma verimini bozar. Bazı tesisler kimyasal antifoam yerine mekanik köpük kırıcı ya da tank üstünde dönen bir köpük ayırıcı kullanır. Seçim, ürünün downstream hassasiyetine göre yapılır.

Peki hücre bu kadar strese rağmen nasıl on binlerce litreye çıkıyor?

Fed-batch, perfusion ve soğuk zincirin başlangıcı

Bir üretim kampanyası tek bir tankta başlamaz. Yolculuk bir mililitreyle başlar.

Çalışma hücre bankasından alınan bir vial çözülür, T-flask'a ekilir, oradan spinner flask'a, oradan küçük bir seed reaktöre geçer. Her adımda hacim kabaca beş ile on kat büyür. Yüz mililitreden iki bin litreye çıkmak tipik olarak üç ile dört hafta sürer. Süre boyunca hücrelerin logaritmik büyüme fazında tutulması gerekir, çünkü duraklayan kültür üretim reaktörüne zayıf girer.

Seed zincirinin her adımında hücrelerin canlılık oranı yüzde doksan beşin üzerinde tutulmalıdır. Eşiğin altına inen bir ara kültür, üretim reaktörüne taşındığında başlangıç yoğunluğunu yakalayamaz ve kampanya takvimi kayar. Yüzde doksan beş eşiği keyfi değil, ölü hücrelerin salgıladığı proteazların ve DNA'nın ortam viskozitesini bozup saflaştırmayı zorlaştırmasından gelir.

Üretim reaktörüne ulaşıldığında iki temel strateji devreye girer. Fed-batch, besini kademeli ekleyip ürünü tankta biriktirme yöntemidir. On dört güne kadar sürer, sonunda tüm sıvı hasat edilir. Perfusion ise sürekli besleme ve sürekli hasat demektir. Hücreler tankta kalır, ürün süzülerek dışarı alınır, taze besin içeri girer. Yöntem daha yüksek hücre yoğunluğu sağlar ama sürekli bir hücre tutma cihazı gerektirir ve kontaminasyon riski katlanır.

Fed-batch'te besleme stratejisi başlı başına bir optimizasyon problemidir. Glikoz ve glutamin gibi temel besinler belirli eşiklerin altına düşmeden eklenmelidir. Glikoz on gram/litre üzerinde kalırsa hücre laktat üretir, iki gram/litre altına inerse üretkenlik düşer. Glutamin ise amonyak birikimine yol açar ve amonyak beş milimolar üzerine çıktığında glikan profili bozulur, sialilasyon azalır. O yüzden modern platformlar glutamin yerine glutamat ya da özel dipeptit beslemeleri kullanır.

Titik asit üretimi açısından bakınca fed-batch tipik olarak litre başına bir ile beş gram arasında monoklonal antikor verir. Perfusion'da bu rakam on gramı aşabilir ama operasyonel karmaşıklık ve maliyet aynı oranda artar. Çoğu ticari tesis fed-batch ile çalışır çünkü ölçeklenmesi, doğrulanması ve denetlenmesi daha öngörülebilirdir.

Sıcaklık da bir kaldıraçtır. Büyüme fazında otuz yedi santigrat, üretim fazında otuz üç santigrat civarına düşürülür. Düşüş hücre bölünmesini yavaşlatır, ölüm oranını azaltır, spesifik üretkenliği artırır. pH ise yedi civarında tutulur, genelde yedi nokta sıfır ile yedi nokta iki arasında. Bir baz çözeltisi ve karbondioksit gazı ile ince ayar yapılır.

Sıcaklık kaymasının etkisi ölçülebilir. Otuz yedi santigrattan otuz üçe inmek, hücre bölünme hızını yaklaşık yarıya indirir ama spesifik üretkenliği iki ile üç kat artırır. Net sonuç, aynı sürede daha az hücreyle daha çok ürün demektir. Takas, hücrenin enerjisini bölünmeye değil protein sentezine yönlendirmesinden gelir. Aynı mantıkla bazı platformlar üretim fazında sodyum bütirat gibi histon deasetilaz inhibitörleri ekler ve kromatin yapısını gevşeterek transkripsiyonu hızlandırır.

Hasat edilen sıvı artık ilaç değil, hammaddedir. Saflaştırma, viral inaktivasyon, konsantrasyon ve dolum aşamaları ayrı bir yazının konusudur. Ama zincirin en pahalı halkası bu tanktır.

Piyasa Hafızası - 1986, Genentech ve ilk onaylı rekombinant aşı

Ekim 1986'da ABD Gıda ve İlaç Dairesi, Genentech'in geliştirdiği rekombinant hepatit B aşısını onayladı. Ürün adı Recombivax HB idi ve maya hücresinde üretilen ilk insan aşısı olarak kayda geçti. Onay, plazma kaynaklı aşılara olan bağımlılığı kırmanın mümkün olduğunu gösterdi. Aynı yıl içinde CHO hücresinden üretilen ilk terapötik protein olan doku plazminojen aktivatörü de klinik kullanıma girdi. İki olay bir arada, hücre kültürünün ilaç üretiminde merkezi bir platform olacağını ilan etti. O günden bu yana CHO hattı, onaylı monoklonal antikorların büyük çoğunluğunun üretim omurgası olarak kaldı ve kırk yıldır yerini alacak bir alternatif endüstriyel ölçekte yerleşmedi.

Küçük Bir Hesap. Bir gram antikorun tanktan çıkış maliyeti

Sayılar temsili, mantık gerçek. Tabloda dikkat çeken şey ortam maliyetinin toplam içinde küçük kalmasıdır. Asıl yük saflaştırma ve kalite kontrol tarafındadır. Titik asit verimini üçten beş grama çıkarmak, gram başına maliyeti yaklaşık yüz dokuz avrodan yetmiş avroya indirir. Aynı iyileştirme, saflaştırma adımında yüzde onluk bir kayıp yaşanırsa geri alınır. Yani biyoreaktörde kazanılan verim, downstream'de korunamazsa buharlaşır.

Duyarlılık tarafı daha çarpıcı. Kampanya süresi on dört günden on iki güne inerse, aynı tesiste yılda çalışılan kampanya sayısı yaklaşık yüzde on beş artar. Yıllık kapasite doğrudan yükselir, sabit maliyetler daha çok grama yayılır. O yüzden endüstride süreç yoğunlaştırma çalışmaları, verim artışından bağımsız olarak başlı başına bir ekonomik kaldıraçtır.

Çelik tankın üç dersi

Birincisi, platform seçimi bir mühendislik kararı değil, biyolojik bir zorunluluktur. CHO hattı kazanmadı çünkü en hızlı ya da en ucuz değildi. Kazandı çünkü insan proteinine yakın glikan profili üretebilen tek ölçeklenebilir sistemdi ve kırk yıldır bu avantajı koruyor.

İkincisi, biyoreaktörün ekonomisi hacimde değil, dar bantlarda saklıdır. İmpeller uç hızı, çözünmüş oksijen, pH, sıcaklık, glikoz ve amonyak eşikleri. Her biri küçük bir aralıkta tutulur ve bu aralıkların dışına çıkmak kampanyayı çöpe atar. Ölçek büyüdükçe bantlar daralır, tolerans azalır.

Üçüncüsü, tankta kazanılan her şey saflaştırmada kaybedilebilir. Verim artışı tek başına anlam taşımaz, downstream kayıplarıyla birlikte okunmalıdır. Gram başına maliyet, iki tarafın çarpımıdır.

Çelik tankın içinde görünen hiçbir şey yok. Ama ilacın fiyatını, tedarik güvenliğini ve bir ülkenin salgın karşısındaki hızını belirleyen şey, o boş görünen hacmin içinde tutulan dar bantlardır.